Die Isolierung und Aufreinigung der Metalloendopeptidase LysN und die Evaluierung der Spezifität der LysN E157D-Mutante und ihr Einsatz in der Proteomik und die Mechanismen der Bildung von “dendritic cell aggresome- like induced structures“ (DALIS)

Der proteolytische Verdau von Proteinen in Peptide ist ein wichtiger Schritt in der Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden Peptide fragmentiert und die sich ergebenden Fragmentionen geben Aufschluss über die Aminosäuresequenz des zu untersuchenden Proteins. Dabei sind für die Fragmentierung sowohl Länge und Sequenz, als auch der Ladungszustand des Peptids ungemein wichtig. Diese Parameter bedingen sich durch Endoproteasen, die für den proteolytischen Verdau eingesetzt werden. Eine Voraussetzung hierfür ist die Spezifität der Protease. Trypsin ist bei weitem die gebräuchlichste Protease zur massenspektrometrischen Probenvorbereitung. Allerdings bietet Trypsin keine Komplettlösung. Je nach Fragestellung und Applikation müssen weitere Proteasen eingesetzt werden, um eine komplette Sequenzabdeckung zu gewährleisten und möglichst alle posttranslationalen Modifikationen nachzuweisen, oder bestimmte Proteomklassen (z.B PhosphoproteomTransmembranproteom) zu charakterisieren. In den letzten Jahren wird vermehrt die Metalloendopeptidase LysN eingesezt, die Peptide N-terminal von Lysin hydrolysiert. Eine rekombinante Gewinnung der Protease gestaltet sich noch immer als äußerst schwierig, weshalb in dieser Arbeit ein Protokoll hierzu etabliert werden sollte. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das thermostabile Enzym über eine bemerkenswerte Stabilität gegenüber Harnstoff (bis 5 M) verfügt und unverminderte Aktivität in einem pH-Wertbereich von 5-10 aufweist. Die generierten Peptide eigneten sich optimal für Tandem-MS, zudem konnte anhand eines BSA-Verdaus eine Sequenzabdeckung von nahezu 90 % gezeigt werden. Zusätzlich wurde eine Mutation in das Enzym eingefügt, so dass sich die Spezifität der Protease dahingehend änderte, dass neben Lysin auch Arginin N-terminal geschnitten wurde. Dadurch wurde eine Protease generiert die über die gleiche Erkennungssequenz verfügt wie Trypsin, allerdings „reverse“ Peptide generiert, da N-terminal, und nicht C-terminal von der Erkennungssequenz hydrolysiert wird. Somit konnte eine spezifische Endopeptidase generiert werden, die durch ihre Eigenschaften und ihre Erkennungssequenz den Pool der zur Verfügung stehenden Endoproteasen ergänzt und somit Einzug in die Massenspektrometrie-basierte Proteomik finden kann. rnDes Weiteren wurden in dieser Arbeit die Mechanismen untersucht, die zur Bildung des „dendritic cell aggresome-like induced structures“ (DALIS) führen. Hierbei handelt es sich um eine Art Antigenpool der aus defekten ribosomalen Produkten besteht. Hierdurch wird es der dendritischen Zelle in einem verlängerten Zeitraum ermöglicht Antigene zu prozessieren, welche in der Regel schnell degradiert werden. Die DALIS-Bildung geht mit dem Aktivierungszustand der Zelle einher, weshalb der Fokus in dieser Arbeit auf Signaltransduktionswege gelegt wurde, die zur Aktivierung der DC beitragen. Einzelne Komponenten wurden gezielt inhibiert und die Auswirkung auf die Bildung von DALIS untersucht. Des Weiteren wurde die Rolle der Caspasen bei der DALIS-Bildung evaluiert. rnThe proteolytic digest of proteins into peptides is an important step within tandem mass spectrometry. Within the process peptides are going to be fragmented and the resulting fragment ions shed light on the amino acid sequence of the protein to be analyzed. For the fragmentation process are the length, the sequence and the charge and of the peptides more than important. These parameters are predetermined by the endoprotease that is used for the digest. One prerequisite is the specificity of the respective protease. Trypsin is nowadays the most widely used protease in mass spectrometric analysis; however it does not offer a universal application. Depending on the question and the application other proteases than trypsin need to be used to ensure complete sequence coverage and the identification of all possible post translational modifications or to characterize special proteomes (e.g. phosphoproteome or transmembraneproteome). Recently, the metalloendopeptidase LysN gets more and more common. It hydrolyzes lysine residues on the N-terminal side. However, still it is a major challenge to isolate or to express the (recombinant) protein. Therefore we aimed to establish a protocol for the recombinant expression of the metalloprotease. Furthermore we could show that the thermostable protease shows a remarkably stability towards Urea (up to 5 M) and undiminished activity from pH 5 to pH 10. The generated peptides were suitable for tandem mass spectrometric analysis, furthermore we could show that a 90 % sequence coverage could be achieved when digesting BSA. Additionally we aimed at a mutation that was introduced into the protease to obtain an altered specificity. After introducing the mutation the now mutated protease was capable of hydrolyzing arginine N-terminal, too. Hence, we generated a protease that has the same recognition sequence as trypsin, however it produces “reverse” peptides, as it hydrolyze on the N-terminal side and not on the c-terminal side like trypsin. Consequently we could generate a novel endopeptidase that due to its specificity and its interesting features complements the available pool of proteases that can be used in mass spectrometry based proteomics. rnThe second chapter deals with the characterization of the mechanisms that lead to the formation of dendritic cell aggresome-like induced structures (DALIS). These structures consist of defective ribosomal products (DRiPs) and resemble a kind of antigen pool that allows the respective cell a prolonged access to these DRiPs for antigen processing. Normally, these products are going to be degraded fastly. The formation of DALIS is correlated to the status of activation of the cell. Therefor we concentrated on signal transduction pathways that lead to the activation of dendritic cells. Components of these cascades were individually inhibited to analyze the effects on the formation of DALIS. Furthermore the role of caspases in DALIS-formation was evaluated.r